人乳頭瘤病毒(humanpapillomavirus，HPV)是一組雙鏈DNA病毒，屬多瘤空泡病毒科，約由8000個堿基對構成。目前已有超過200種HPV型別，并且各項研究不斷的發現新的HPV型別。HPV與多種皮膚黏膜疾病相關，其中包括良性和惡性的增生病變皮膚型HPV大部分為Beta屬，小部分屬Alpha屬、Gamma屬、Mu屬和Nu屬。可引起數種皮膚型疾病，例如良性皮膚疣，日光性角化病(AKs)和非黑素瘤皮膚癌(NMSCs)。在健康人的皮膚上也常常檢出皮膚HPV型別。皮膚型HPV感染中最常見的疾病即為皮膚疣類疾病，可分為尋常疣、跖疣和扁平疣這三大類，不同的HPV型別感染可導致不同的皮膚疣疾病的發生。尋常疣多由HPVl、2、4型感染引起，HPV2型別可能是引起人群手、足尋常疣的最常見型別。扁平疣則多由HPV3、10、28引起。且不同的HPV型別引起的皮膚疣臨床表現都略有不同，例如角化程度的不同。且HPV的感染具有顯著的地域差異，通過對本地區患者HPV感染型別的檢測，結合對治療效果的分析，從而對推動皮膚疣個體化治療方案的實施提供分子流行病學依據。但是目前絕大部分的HPV檢測方法是針對黏膜型HPV，缺乏一種成熟的可應用于臨床的皮膚型HPV檢測方法。

環介導等溫擴增技術(LAMP)是一種可在恒溫條件下擴增DNA的技術，反應過程為4套特異性引物特異性結合目標DNA的6個位點，并由BstDNA聚合酶催化自動擴增鏈置換DNA。該技術有著耗時少、花費低以及不需專業儀器等優點，與其他DNA擴增方法相比，有著明顯的優勢。也因此，LAMP技術常作為一個低成本基因分析工具被用于資源貧乏地區。LAMP方法的敏感性并不會因為樣本中非目標DNA的存在而受到影響，因此該方法的應用范圍也較PCR更為廣泛。更為突出的優勢是，它的敏感性與特異性均要高于PCR很爹，由于LAMP反應中引物必須結合目標DNA的6個特異性位點，該方法的特異性會明顯的高于其他檢測方法。LAMP反應的結果判定也十分方便。在LAMP反應過程中dNTP可釋放大量的焦磷酸鹽離子，可與反應緩沖液中的鎂離子結合，形成白色沉淀。當大量的白色沉淀形成后即可肉眼觀測反應結果。在本研究中將采用加入羥基萘酚藍(HNB)進行比色檢測，HNB作為指示劑直接加入LAMP反應液中與M92+結合，使反應液呈現紫色。在反應過程中，由于大量不溶性焦磷酸鎂鹽的產生，導致了溶液中M92+的大量減少，溶液的顏色由紫色變為了天藍色。由于這種方法觀測結果更為快速簡便，也已經被大量運用。

LAMP已經作為一個方便快速準確的核酸擴增方法己被廣泛運用于病原檢測，如人類免疫缺陷病毒、急性呼吸系統綜合征冠狀病毒、乙肝病毒和H5禽流感病毒等。相較于其他的病原檢測方法來說，LAMP技術要準確和快捷許多，但是大多數的LAMP檢測方法仍是在聚丙烯試管中進行，反應過程需要數十至數百微升體積的溶液，這限制了LAMP反應的批量化和微量化，并不利于構建完整的診斷體系。同時由于LAMP反應的高靈敏性，也導致了假陽性率的增高，這也成為了LAMP技術應用于病原檢測的一個待解決問題。

現微流控技術已經應用于芯片實驗室(1ab—on-chip)系統中，所構成的微流控芯片可以達到在毛細通道中操控微量溶液反應，可以在一張芯片中同時做到反應、檢測和結果判定，構成一個高通量、低成本的密封反應體系。將LAMP技術與微流控芯片相結合，即可得到一個微量的LAMP反應體系，同時密封的反應體系也大大降低了假陽性率，促進即時(POC)病原檢測系統建立的實王見。

本研究旨在將LAMP反應與微流控芯片技術相結合，滿足臨床中對皮膚型HPV的分型檢測需要，研究出一種實用、準確、特異及靈敏的皮膚型HPV檢測方法。

主要儀器

(1) ABIStepOnerealtimePCR儀

(2)水浴鍋

(3)平板式掃描儀

(4)天能4100凝膠圖像分析系統

主要試劑

(1) LAMP試劑一NewEnglandBioLabs其中包括：①Bst2．0DNA聚合酶，⑦10xThermoPolreactionbuffer

(2) PCR試劑一TaKaRa公司其中包括：(DpfuDNA聚合酶(2．5U)⑦dNTP③10xpfuBuffer④SYBRGreenI

(3) 標準病毒核酸、引物合成及PCR結果測序均由華大基因提供

實驗方法

1構建以微流控技術及LAMP反應為基礎的HPV檢測方法

(1) 于http://primerexplorer.html在線LAMP引物設計網站進行HPV特異性引物的設計，每型別各設計四組引物，對四組引物分別在離心管中進行擴增反應，反應體系為25ul，分別為內引物FIP和BIP各1．6laM，外引物F3和B3各0．2uM，dNTP1．4uM，SYBRGreenI1201．tM，BstDNA聚合酶8U，MgS048mM，10xThermoPolreactionbufie(10mMKCl，IOmM(NH4)2804，20mMTris．HCl，0．1％吐溫20，0．8M甜菜堿)，lng標準病毒核酸DNA(以下簡稱為質粒DNA)。同時設置四組陰性對照，將上述反應體系中質粒DNA用ddH20代替。將離心管放入熒光PCR中反應，設置溫度為60℃，反應60min。觀察每組引物的擴增效率，篩選擴增效率較好的引物。

(2) 檢測30種HPV型別相互間特異性，實驗用微流控芯片有8個反應孔，每一實驗均有陽性對照組以及至少一個陰性對照組，將30個型別按照高危型和低危型分為皮膚低危型別組、皮膚高危型別組及皮膚罕見型別組，每6個型別為一小組，皮膚低危型別組由3個小組組成，皮膚高危型別及皮膚罕見型別各1個小組(見表1)，特異性驗證在各組內進行，保證每小組內各HPV型別之間特異性較好的基礎上，盡量保證小組組間特異性，并將小組組間交叉反應型別控制到最小。首先在利用離心管進行LAMP反應，篩選特異性佳的引物，反應體系為25ul，除了用HNB取代SYBRGreenI之外，反應體系同上，水浴60℃反應60min，直接觀測顏色變化判斷試驗結果，陽性結果為天藍色，陰性結果為紫羅蘭色。30種HPV型別引物篩選完成后，在微流控芯片中重復試驗，驗證結果，芯片中加入待驗證型別引物O．8ul，陽性對照組為反應體系中的質粒HPV型別引物，陰性對照組為空，自然風干后，注入無引物LAMP反應液(751．1l，反應體系同上)，水浴60。C反應60min，直接觀測顏色變化判斷試驗結果，陽性結果為天藍色，陰性結果為紫羅蘭色。

表130種HPV型別具體分組

(3) 檢測各型別引物的靈敏性，將各型別HPVDNA質粒溶液分級稀釋為108copies／lal，107copies／ul，106copies／lal。使用微流控芯片進行實驗，芯片中加入6種待驗證型別引物0．8ul，剩余兩孔為空，設置為陰性對照組，注入無引物LAMP反應液，反應體系為75ul，體系中加入待檢測的6種HPV型別質粒DNA各3ng，其余同上，60。C水浴反應60min，直接觀察顏色判斷試驗結果，陽性結果為天藍色，陰性結果為紫羅蘭色。

2評價新構建HPV檢測體系

(1) 使用新構建方法檢測皮膚疣臨床樣本型別。樣本來自中國醫科大學附屬第一醫院皮膚科門診皮膚疣病人，使用低危型別組芯片進行檢測，LAMP反應體系中加入臨床樣本DNA3ng，反應體系同上，60。C水浴反應60min，直接觀察顏色判斷試驗結果，陽性結果為天藍色，陰性結果為紫羅蘭色。

(2) 使用PCR方法檢測同一批臨床樣本HPV型別，使用皮膚型HPV通用引物FAP6085／64，反應體系為25ul，分別為10×pfuBuffer2．5ul，dNTP0．2laM，pfuDNA聚合酶5U，FAP6085／64引物溶液各6．4mM，質粒DNA2ng，PCR條件：95。C預加熱5min之后，94。C保持50s，49。C保持50s，72。C保持50s，進行60個循環。將PCR產物加入10％瓊脂糖凝膠中進行電泳分析，并將剩余PCR產物送出測序，測序結果經BLAST比對后，確定HPV具體型別。

(3) )將兩種檢測方法結果進行比對，以PCR測序法作為黃金標準，評價新構建的檢測方法的特異性和靈敏性。

結果

1．引物篩選

每HPV型別各設計4組引物，選取在30個循環數內擴增且無非特異性擴增的引物進入下一步的特異性檢測(如圖1)，篩選結果示各型別均有多組引物符合引物篩選要求。

圖1HPVl引物擴增曲線

圖中1線代表HPVl型別第一組引物擴增曲線。2線代表HPVI型別第二組引物擴增曲線。3線代表HPVl型別第三組引物擴增曲線。4線代表HPVI型別第四組引物擴增曲線。5線代表無質粒DNA的陰性對照組。

2．特異性檢測

5個小組組內HPV型別均無交叉反應出現，特異性佳(見圖，2、3、4)，皮膚低危型別中3個小組間特異性檢測結果(見圖5)，其中HPV2引物可被HPV3質粒DNA擴增，HPV3引物可被HPVl25質粒DNA擴增，HPV75引物可被HPV76質粒DNA所擴增(見表2)，其余皮膚低危組HPV型別小組間均無交叉反應，特應性佳。

圖2皮膚低危型別中3小組組內特異性檢測

圖5皮膚低危型別中3小組組問特異性檢測

圖中A代表l小組與2、3小組間特異性檢測，B代表2小組與l、3小組問特異性檢舅，C代表3小組與l、2小組問特異性檢測。

表2皮膚低危型別組內出現交叉反應的HPV型別

3.靈敏性檢測

30種HPV型別引物均在質粒DNA溶液濃度為107copies／ill時產生擴增反應，出現陽性結果(見圖6、7、8)，可以得出該檢測體系的靈敏性為可檢測的病毒DNA濃度最低達107copies]lil．具體引物序列見表3．

圖6皮膚低危型別組3個小組I-IPV型別靈t性檢舅

圈中A代表I小組靈t性檢測，B代衰2小組靈t性檢測．C代衰3小姐更t性檢一。

圖7皮膚高危型別組HPV型別靈敏性檢測

圖8皮膚罕見型別組I-IPV型別靈敏性檢測

本檢測方法操作簡單，不需專業技術人員即可操作，需要的儀器簡單，普通水浴鍋即可，加上微流控反應體系和高通量反應的特點，大大降低了臨床檢測的成本，節約了臨床檢測時間，短時間內(60min)即可目測出結果，且檢測的靈敏性及特異性均高，可進行臨床大規模樣本檢測，同時適用于研究HPV感染的流行病學和正常人的HPV感染篩查。本課題只檢測了85例臨床樣本，仍需大量臨床樣本檢測數據，完善數據分析，結合臨床上治療方法的治療效果，分析各治療方法對感染不同HPV型別的病例的治療效果，從而達到精準醫療的目的，同時通過檢測HPV感染型別的具體類型，可輔助判斷疾病的良惡性，對疾病的診斷及預后判斷有著極大的幫助，另一方面，通過對本地區的HPV感染的流行病學調查，為研制特異性的HPV病毒基因預防性疫苗提供了可靠的分子流行病學依據。

本課題新構建的皮膚型HPV檢測體系初步構建完成，該體系具有高靈敏性及高特異性的特點，結合其低成本、高通量及操作快速簡單的特點，滿足了臨床檢測的需要，彌補了皮膚型HPV檢測這一領域的空白。

（文章來源：中國醫科大學作者葛格節選部分文章科學網科學網轉載僅供參考學習及傳遞有用信息，版權歸原作者所有，如侵犯權益，請聯系刪除）