隨著技術的進步,外泌體檢測的各種方法不斷涌現,前面介紹的方法往往需要相對龐大和復雜的實驗室基礎設施。近年來,微流控技術高速發展,許多基于微流控技術的外泌體檢測方法不斷被報道,這些檢測方法具有分析速度快、靈敏度高、試劑消耗少、攜帶方便等優點。此外,微流控技術易于模塊化并可多單元集成,這意味著可以將外泌體的純化、富集和檢測整合到微流控平臺上,為臨床發現外泌體生物標志物和對腫瘤等疾病的診斷與預后提供巨大的潛力。目前基于微流控的外泌體分析方法大致可以分為:熒光檢測、表面等離子體共振、核磁共振、數字液滴PCR、電化學傳感等,下面將對提到的這幾種方法進行詳細的介紹。

4.1 熒光檢測

熒光是一種物質在吸收光照或者其他電磁輻射后出現冷發光的現象。其熒光強度、波長、發光時間與材料的性質有關。因此,觀測熒光的發射參數可以用來檢測目標樣品。熒光成像技術具有精度高、靈敏度高等優點,已廣泛應用于微流控芯片的外泌體檢測系統中。近期的研究報道中,Ai等建立了一種微流控水動力分析平臺,該平臺首先利用微珠對溶液中的外泌體進行初步的捕獲,然后利用微流控芯片將富集有外泌體的微珠進行分散與固定,在芯片上實現了外泌體的大規模多重熒光分析(見圖6a)。

而Hansford等則構建了一種經過抗體功能化的人字形溝槽微流控裝置,在實驗中,研究人員將其用于高級別漿液性卵巢癌病人血清中外泌體的分析,利用熒光顯微鏡對微流控芯片捕獲和釋放的外泌體進行表征,從而實現了外泌體的洗脫過程的動態監測(見圖6b)。流式細胞術(FCM)和微流控技術相結合在外泌體檢測方面也有很大的潛力。一種基于微流控技術的多功能流式細胞儀成像檢測系統已被用于卵巢癌的早期檢測,該方法通過建立由平行納米通道組成的流式細胞術陣列,成功地實現了外泌體的計數。從發展趨勢來看,基于微流控芯片的熒光檢測方法在外泌體檢測中的應用將會越來越廣泛。

4.2 表面等離子體共振

表面等離子體共振(SPR)是一種無標簽的實時跟蹤傳感技術,通過分子吸附在金屬表面引起的折射率改變實現對生物分子的痕量分析。近年來,基于SPR技術的納米傳感器因其在分子檢測上的高靈敏性而備受關注。Hu等開發了一種基于SPR的外泌體微流控芯片傳感器,實驗中該團隊將抗體修飾在金的表面,在利用抗體微陣列捕獲外泌體后,金表面的折射率發生改變,實現了對腫瘤細胞培養液中的外泌體的定量檢測,為外泌體的分離分析提供了一種簡便、高效的策略。

4.3 核磁共振

核磁共振現象(nuclear magnetic resonance, NMR)是一種基于磁矩不為零的原子核在外磁場作用下自旋能級發生塞曼分裂,共振吸收某一定頻率的射頻輻射的物理過程,由Purcell和Bloch在1946年發現。NMR是化學分析中的一項重要技術,Lee等將用于NMR測量的微線圈嵌入到微流控芯片的中間層,用抗體和外泌體作用后與磁性納米顆粒進行偶聯,使用內置微線圈進行核磁共振測量,以確定樣品的R2值,實現了對外泌體膜蛋白的檢測。

圖6   微流控芯片與熒光檢測聯用用于外泌體檢測

4.4 數字聚合酶鏈式反應

數字聚合酶鏈反應(dPCR)是一種絕對定量的方法,它將含有核酸模板的標準PCR反應體系,平均分配成上萬個和數百萬個PCR反應,使每個反應中盡可能含有一個模板分子,在單分子水平上進行大規模的平行PCR分析。dPCR檢測目標基因更可靠,不需要校準曲線。由于其高靈敏度,dPCR已廣泛應用于多個領域,包括單細胞分析、突變檢測、拷貝數變異分析、細菌和病毒檢測等。可以設想,隨著微尺度樣品處理與dPCR分析的集成,該技術將成為臨床樣本中外泌體基因分析的有力工具。

4.5 電化學傳感

電化學分析方法因其具有成本低、時效性好、靈敏度高、樣品量少等優點在生化檢測領域受到廣泛關注。在電化學檢測過程中,將識別元件(如抗體、適配體等)修飾到化學電極上與外泌體特異性結合,再利用不同的電化學檢測技術(包括伏安法、安培法、阻抗法、電位法等)對電極進行檢測便可以獲取樣品中外泌體的濃度和表面蛋白等信息。Revzin等報道了一種基于適配體的電化學生物傳感器用于外泌體的定量檢測:將外泌體跨膜蛋白CD63適配體固定在金電極表面上與含有亞甲基藍標記的探針鏈雜交,當檢測到外泌體時,探針鏈會釋放出來,電化學信號以與分析物濃度成正比的方式降低;將該裝置整合到微流控芯片中,可以對外泌體濃度在1×106~1×108個粒子/mL的樣本進行定量檢測。Ye等則以聚二甲基硅氧烷為主要材料,構建了內部含有人字形微陣列結構的電化學檢測芯片(見圖7),當檢測到外泌體跨膜蛋白CD63時,吸附有外泌體的磁珠可與一種DNA發卡結構結合,在血清素的作用下,發卡結構異構成G-四聚體結構,對過氧化氫分解具有高效的催化作用,而產生強烈的電化學信號,從而實現對外泌體的檢測;在對臨床血清樣品中CD63陽性外泌體定量檢測中,文中開發的兩步級聯微流控平臺,可以實現對健康組和疾病組的外泌體含量的靈敏區分。

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