微生物分類復(fù)雜，種類繁多，形態(tài)特征多樣并且具有很強(qiáng)的突變能力，除此之外，大多數(shù)微生物在目前都是無法人為培養(yǎng)的。因此，亟須利用新的技術(shù)手段去分離、培養(yǎng)、篩選、鑒定與分析微生物群落。液滴微流控技術(shù)是微流控技術(shù)的主要分支，是指對(duì)極小體積液流（10－9~10－15 L）進(jìn)行精確控制的技術(shù)，這一技術(shù)的出現(xiàn)為解決很多生物學(xué)問題提供了新的方法。

液滴微流控技術(shù)用于微生物研究有以下幾個(gè)特點(diǎn)：①將微生物封裝在液滴中，使得少量甚至單個(gè)細(xì)胞處于隔離的環(huán)境中，消除了生長速率差異和種間競爭的影響，有利于研究復(fù)雜樣本中的稀有和生長緩慢的微生物，液滴中代謝物的快速積累有助于激活例如群體感應(yīng)等濃度依賴的生理通路。②微流控裝置能以高達(dá)20000 Hz的頻率產(chǎn)生高度均一的液滴并且進(jìn)行高通量分析，使得超高通量的鑒定、篩選微生物成為了可能。③在液滴微流控系統(tǒng)中，可根據(jù)研究目的定制設(shè)計(jì)通道和集成多種控制模塊以實(shí)現(xiàn)液滴的精確操控，包括注入、混合、分散，長時(shí)間孵育及分選等操作，因此可以快速且精確的向微生物細(xì)胞中引入多種檢測試劑和刺激因素，制造出多樣且可控的環(huán)境，以達(dá)到高通量且精確的操控微生物細(xì)胞的目的。

微生物的液滴微流控技術(shù)主要由以下幾個(gè)部分組成：①液滴生成，包括生成單相分散的液滴、液滴陣列和由不同材料構(gòu)成的液滴表面或液滴內(nèi)組分；②操控液滴和液滴內(nèi)的組分；③對(duì)液滴內(nèi)微生物進(jìn)行分析。將液滴微流控技術(shù)與前沿的測序、動(dòng)態(tài)熒光成像等技術(shù)以及新的生物信息學(xué)分析方法相結(jié)合，會(huì)極大地幫助我們進(jìn)一步了解和研究微生物的世界。本文將對(duì)近年來液滴微流控技術(shù)在微生物研究的多個(gè)方面的應(yīng)用進(jìn)行介紹和討論，以期為微生物和微流控技術(shù)的研究者們提供一定的參考。

1.   微生物的高通量單細(xì)胞培養(yǎng)和分離

傳統(tǒng)的微生物培養(yǎng)方法不僅培養(yǎng)耗時(shí)長且需要較復(fù)雜的操作，而且由于細(xì)菌的種間抑制作用以及有些微生物的生長速度緩慢甚至無法生長導(dǎo)致一部分微生物的信息被忽略。基于液滴微流控的微生物培養(yǎng)技術(shù)能夠通過把一小群甚至單個(gè)微生物置于液滴中培養(yǎng)，避免了種間競爭的影響，達(dá)到精確的控制微生物的生長環(huán)境以及分離傳統(tǒng)方法不能培養(yǎng)的微生物的目的。

MARTIN等第一次使用單相分散的液滴用于高通量的微生物培養(yǎng)，證實(shí)微液滴均適用于從單細(xì)胞到非常高密度的細(xì)胞培養(yǎng)。接著，很多基于液滴培養(yǎng)的新技術(shù)先后被報(bào)道，如用體積低至10－12 L超微小液滴用于細(xì)菌群體感應(yīng)研究，發(fā)現(xiàn)一個(gè)單細(xì)胞也能啟動(dòng)群體感應(yīng)中的高密度行為。微生物在獨(dú)立液體中的生長狀態(tài)可以通過在明場下記錄細(xì)胞的數(shù)量或基于熒光強(qiáng)度隨時(shí)間的變化強(qiáng)度來進(jìn)行動(dòng)態(tài)監(jiān)測。與可視化的檢測技術(shù)相比，分子技術(shù)，比如定量PCR和基因測序能更加系統(tǒng)性地研究液滴中微生物的生長。VILLA等開發(fā)出MicDrop平臺(tái)用于在微液滴中分離和培養(yǎng)人腸道微生物，結(jié)合DNA測序和16S rRNA定量技術(shù)檢測腸道微生物中菌種的絕對(duì)水平。使用這一技術(shù)也可對(duì)糞便樣本中各類腸道微生物的碳水化合物利用水平進(jìn)行測定。

基于液滴微流控技術(shù)的微生物培養(yǎng)使得從復(fù)雜的微生物群落中分離稀有或難培養(yǎng)的微生物變得更加便捷。JIANG等[20]利用微流控平板劃線（microfluidic streak plate, MSP）進(jìn)行高通量的單微生物分離和培養(yǎng)，微流控裝置產(chǎn)生的液滴在預(yù)先填充載體油的培養(yǎng)皿上劃線，形成固著的液滴陣列。

相比于傳統(tǒng)的瓊脂平板劃線，微流控平板劃線具有以下優(yōu)點(diǎn)：①更高的培養(yǎng)通量及更低的試劑和樣本消耗；②消除了種間競爭和生長速率差異的影響；③載體油上的液滴支持長達(dá)5個(gè)月的單細(xì)胞培養(yǎng)；④允許培養(yǎng)過程中用顯微鏡觀察；⑤培養(yǎng)后，可以使用下一代測序技術(shù)進(jìn)行微生物群落分析以及擴(kuò)大培養(yǎng)；⑥MSP使用液體培養(yǎng)基避免了瓊脂凝固過程中產(chǎn)生的過氧化氫，利于分離和培養(yǎng)過氧化氫敏感的微生物。 ZHOU等利用MSP平臺(tái)從黑胸散白蟻（Reticulitermes chinensis）中分離了幾株潛在的新菌種。CHEN等結(jié)合MSP和趨化篩選方法從土壤樣本中分離出了能降解咪唑啉酮的微生物種類。HU等利用MSP平臺(tái)支持長期培養(yǎng)的特性，解決了分離稀有海洋微生物的難題。綜上，這些研究證實(shí)液體微流控技術(shù)可用于高通量培養(yǎng)來自多種環(huán)境中的細(xì)菌樣本并且能顯著提高分離效率。

2.   微生物的高通量檢測、鑒定和微生物組研究

微生物檢測和鑒定對(duì)微生物基礎(chǔ)研究、食品微生物檢驗(yàn)和感染性疾病診斷至關(guān)重要。由于液滴微流控技術(shù)高速和高通量的特性，可作為一個(gè)用于高通量和高度平行的微生物分析的理想平臺(tái)。近期，多種檢測手段被用于分析微液滴中的微生物，包括各種光學(xué)技術(shù)、數(shù)字PCR和下一代測序技術(shù)。

2.1   液滴光學(xué)檢測技術(shù)

將熒光原位雜交技術(shù)（fluorescence in situ hybridization, FISH）與液滴微流控技術(shù)結(jié)合可進(jìn)行高通量的微生物檢測和鑒定。HSIEH等開出發(fā)了刃天青增強(qiáng)微陣列檢測（resazurin-amplified picoarray detection, RAPiD）用于簡便精準(zhǔn)地對(duì)活細(xì)菌進(jìn)行計(jì)數(shù)。為了避免熒光標(biāo)簽對(duì)細(xì)菌正常生理活動(dòng)的潛在影響，無標(biāo)記和無創(chuàng)的單細(xì)胞拉曼光譜技術(shù)（single-cell Raman spectrum, SCRS）被應(yīng)用于微液滴中的微生物檢測，它是一種基于分子振動(dòng)信號(hào)的代謝物檢測技術(shù)，可提供單個(gè)細(xì)胞內(nèi)源性的生化“指紋”。結(jié)合SCRS與基因組測序技術(shù)，可系統(tǒng)性地研究單個(gè)細(xì)胞的基因組與代謝組，WANG等利用且改進(jìn)了這一技術(shù)系統(tǒng)，并發(fā)現(xiàn)了酵母中以前從未被鑒定到的兩個(gè)二酰甘油?；D(zhuǎn)移酶變體。

2.2   液滴數(shù)字PCR

液滴微流控技術(shù)的出現(xiàn)進(jìn)一步革新了數(shù)字PCR技術(shù)，并直接催生了液滴數(shù)字PCR（droplet digital PCR, ddPCR），在ddPCR中，DNA分子被隨機(jī)送入每個(gè)小液滴中并進(jìn)行常規(guī)的PCR，由于反應(yīng)混合物中含熒光探針，根據(jù)熒光強(qiáng)度可計(jì)算出原始樣本中目標(biāo)DNA的拷貝數(shù)，因此ddPCR可用于對(duì)樣本中的目的微生物進(jìn)行檢測并定量。ddPCR與測序技術(shù)結(jié)合可用于測定復(fù)雜群落中的單個(gè)微生物類群的絕對(duì)豐度，如用于測定小鼠腸腔和黏膜樣本中各細(xì)菌種類豐度受飲食的影響。ddPCR在診斷早期病毒感染中也有著優(yōu)勢。DONG等將ddPCR用于禽類腺病毒的快速檢測，ddPCR的敏感性比傳統(tǒng)的PCR檢測方法高1000倍。后來的研究者對(duì)ddPCR進(jìn)行進(jìn)一步改進(jìn)，并用于定量檢測BK病毒、乙肝病毒、人類乳頭瘤病毒等。將ddPCR改進(jìn)并用于新冠病毒SARS-CoV-2檢測，顯著減少了由于咽拭子樣本中病毒載量少造成的假陰性率并提高了效率。

2.3   液滴測序技術(shù)用于微生物組研究

將液滴微流控與下一代測序技術(shù)結(jié)合能避免傳統(tǒng)的16S rRNA測序和宏基因組測序?qū)е碌膯渭?xì)胞水平上的異質(zhì)性以及空間微生物組信息的丟失。液滴微流控技術(shù)與16S rRNA測序以及宏基因組測序技術(shù)的結(jié)合產(chǎn)生了MaPS-seq（metagenomic plot sampling by sequencing）技術(shù)，該技術(shù)是研究復(fù)雜生境中微生物空間分布的一種很有前景的技術(shù)，它已被用于研究小鼠腸道不同區(qū)域的微生物組，揭示了特定種群間的各種分布關(guān)系。SHI等整合微生物富集微流控裝置和基于液滴的MDA（multiple displacement amplification）技術(shù)用于制備痰液中呼吸道微生物組的DNA用于宏基因組測序，與直接測序相比，該方法在菌株水平上呈現(xiàn)出更大的微生物群落復(fù)雜性和更多的基因組信息，并且對(duì)識(shí)別原噬菌體和DNA病毒具有更高的敏感性。近期，基于液滴微流控技術(shù)的微生物高通量單細(xì)胞基因組學(xué)技術(shù)——Microbe-seq被開發(fā)了出來，它可獲取大量單一微生物細(xì)胞的基因組信息，并將微生物群落的基因組信息精確到菌株水平。利用該方法從一個(gè)健康個(gè)體的腸道微生物系統(tǒng)中獲取了21914個(gè)單一微生物的基因組信息，從中組裝出76個(gè)菌種的基因組序列，其中有10個(gè)菌種包含不同的菌株。利用這些菌株水平的基因組研究微生物相互作用，構(gòu)建了在該人體腸道微生物群落中的水平基因轉(zhuǎn)移網(wǎng)絡(luò)并且發(fā)現(xiàn)92組菌種之間的水平基因轉(zhuǎn)移。

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