為了量化納米結(jié)構(gòu)內(nèi)的滑移速度和渦流強度，我們估計了扁平PET、PSNF和BSNF的渦度強度和平均速度分布（圖3g-i）。速度剖面顯示，PSNF表現(xiàn)出相當大的滑移速度和滑移長度（y截距）。然而，BSNF顯示出高出10倍的滑移性能（（圖3i）。BSNF上強大的滑移流也促使納米結(jié)構(gòu)內(nèi)出現(xiàn)強烈的渦流，渦度強度為4.0×10?3 s?1（BSNF）和2.2×10?3 s?1（PSNF）。值得注意的是，圖3j表明渦度強度預(yù)測了兩個捕獲測試的結(jié)果。此外，如果我們評估速度剖面在表面上的斜率，它與壁剪應(yīng)力成正比，我們還可以估計納米結(jié)構(gòu)的滑移質(zhì)量。BSNF 和 PSNF 的斜率 （~1） 比以前研究中提出的其他納米結(jié)構(gòu)（例如，大約 60）25 小得多，這可能是由于納米結(jié)構(gòu)包含具有最小固體分區(qū)的大空隙。

圖4：BSNFs芯片上病原體和NA富集/分離的評估

最后，我們執(zhí)行了粒子接近測試，以直接可視化BSNF上的滑移流（圖3k）。當我們在完美的滑移條件下以理想的無粘性流動將溶液中的 10 μm 熒光顆粒推向垂直排列的固體表面時，流線（或粒子軌跡）顯示二維停滯流，在固體表面的中心有一個停滯點。雖然微尺度顆粒無法追蹤納米級多孔結(jié)構(gòu)內(nèi)部或正上方的流體流動，但它們可以定性地繪制流體流線和表面附近的邊界層，這將根據(jù)表面的滑移長度和/或滲透率而改變。在這種情況下，裸PET上流速為零的防滑壁阻止了顆粒在膜附近流動，從而導(dǎo)致停滯點和表面附近出現(xiàn)熒光空位。然而，BSNF憑借其增強的滑移流量，可以將該距離降低到22.5μm（~61%），這表明目標可以更容易地接近并被BSNF捕獲。

BSNFs芯片的病原體和NA富集/分離評估

圖5：從BSNFs芯片中提取的SARS-CoV-2 RNA的高靈敏度PCR檢測

我們利用上述BSNF的增強捕獲效率，使用BSNF芯片進行了富集和分離病原體和NA的實驗。補充圖 10 直觀地描述了使用 BSNFs 芯片的病原體和 NA 富集/分離過程。在微通道內(nèi)，使用ADH捕獲帶負電荷的病原體和NA并將其富集在芯片表面，隨后使用高pH值（pH 10–11）洗脫緩沖液進行分離（補充圖11）。通過采用ADH作為非離液性和同型雙官能團的肼交聯(lián)劑，BSNFs芯片消除了對離液劑的需求，從而防止了NA降解。我們最初評估了樣品制備芯片定量逆轉(zhuǎn)錄PCR（qRT-PCR）的病原體和NA富集效率，并將這些結(jié)果與使用常規(guī)NA分離方法獲得的結(jié)果進行了比較。圖4a顯示了常規(guī)方法（無富集分離）、兩步法和一步法的示意圖概述。與傳統(tǒng)方法相比，兩步法顯示出更低的循環(huán)閾值 （Ct） 值，表明芯片有效地富集了病原體（圖 4b）。此外，采用樣品制備芯片的NA富集能力的1-Step方法顯示出比2-Step方法更低的Ct值。此外，在兩步法和一步法中，Ct值在Flat-、PSNFs-和BSNFs-芯片的順序上呈下降趨勢，這與表面結(jié)合效率的提高相關(guān)。值得注意的是，采用一步法的BSNFs芯片表現(xiàn)出卓越的捕獲效率和幾乎相同的絕對Ct值。

為了驗證樣品制備芯片在NA檢測靈敏度方面的提高，我們評估了1-Step方法的LOD，使用HCT116細胞的連續(xù)稀釋液進行細胞、基因組DNA和RNA富集，以及SARS-CoV-2培養(yǎng)液進行病毒和病毒RNA富集。樣品制備芯片有效地將每個細胞和病毒樣品濃縮從 1 ml 濃縮到最終體積 100 μl。這些特征導(dǎo)致通過平芯片處理的所有樣品的 Ct 值較低，表明與傳統(tǒng)方法相比，平芯片的 LOD 降低了 10 倍（圖 4c-e）。此外，PSNFs和BSNFs芯片不僅通過納米結(jié)構(gòu)濃縮了病原體/NAs，而且富集了病原體/NAs，導(dǎo)致Ct值和LOD低于Flat-chip。這些差異可歸因于以下因素：DNA穩(wěn)健的雙螺旋結(jié)構(gòu)和RNA不穩(wěn)定的單鏈結(jié)構(gòu)之間的化學(xué)穩(wěn)定性不同，與帶正電荷的基團的差異靜電偶聯(lián)，以及qRT-PCR中RNA所需的額外逆轉(zhuǎn)錄步驟。在芯片制造后，通過SEM成像和FT-IR光譜在2周內(nèi)確認了BSNFs芯片的穩(wěn)定性。即使在用于病原體和 NA 富集/分離后，BSNFs-chip 的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性也得到了證實。這種魯棒性使BSNFs芯片適用于一次性和可重復(fù)使用的應(yīng)用。值得注意的是，該芯片在多次使用中表現(xiàn)出一致的性能，首次使用的 Ct 值為 27.78 ± 0.13，第二次使用的 Ct 值為 27.3 ± 0.35，第三次使用的 Ct 值為 27.03 ± 0.30，表明具有高重現(xiàn)性。這些結(jié)果進一步確立了BSNFs芯片作為傳染病準確診斷的有前途的樣品制備平臺的地位，凸顯了其作為傳染病靈敏和精確診斷的可靠工具的潛力。

對SARS-CoV-2患者和健康人的臨床樣本中的RNA進行免PCR檢測

為了應(yīng)對SARS-CoV-2檢測的復(fù)雜性和耗時的qRT-PCR的挑戰(zhàn)，我們設(shè)計了一種基于納米顆粒的LRET檢測方法，作為一種快速和簡化的替代方案。該測定利用能量供體和受體之間距離依賴性非輻射能量轉(zhuǎn)移的原理，無需復(fù)雜的步驟即可進行靶標識別。我們設(shè)計了一種將一步法樣品制備芯片和 LRET 檢測相結(jié)合的策略，從而將 SARS-CoV-2 診斷的樣本到答案時間從幾個小時大幅縮短到一小時以內(nèi)。該策略首先使用 BSNFs 芯片富集/分離病原體和 NA，然后使用 LRET 測定鑒定富集的靶 RNA，從樣本收集到獲得 SARS-CoV-2 檢測結(jié)果的整個過程在 50 分鐘內(nèi)完成（圖 5a）。LRET系統(tǒng)由核/活性殼/殼鑭系元素摻雜的納米顆粒和IRdye800組成。與靶位點互補的鏈是刺突（S）基因鏈的一部分，被分成兩個半序列，然后在LRET供體（18 bp DNA）和受體（20 bp DNA）的表面上進行修飾。在 SARS-CoV-2 RNA 存在的情況下，互補對之間發(fā)生寡核苷酸雜交，使 LRET 供體和受體非常接近。該特性允許供體附近的受體在980 nm激發(fā)下通過LRET吸收供體的800 nm發(fā)射。相對強度隨著靶RNA濃度的增加而增加，其計算為LRET供體的發(fā)光強度降低的比率。此外，LRET 供體和受體表面的 DNA 寡核苷酸可以特異性雜交到 SARS-CoV-2 RNA，與其他非靶標 NA 沒有明顯的交叉反應(yīng)性。我們使用 1 pM 其他常見傳染性呼吸道病毒的非靶序列驗證了 LRET 測定的特異性。LRET 檢測成功將 SARS-CoV-2 與人類冠狀病毒 OC43 、hCoV-NL63、hCoV-229E 和甲型流感病毒 （IAV） 區(qū)分開來。

我們使用 10 倍連續(xù)稀釋的全長 SARS-CoV-2 基因組 RNA評估了 LRET 測定的分析靈敏度，范圍為 10?1 至 104 PFU。相對強度與SARS-CoV-2 RNA的對數(shù)濃度呈線性關(guān)系，范圍為10-1至10-3 PFU，相關(guān)系數(shù)（R2）為0.998（圖5c）。所有樣本的檢測結(jié)果均與陰性對照組有統(tǒng)計學(xué)差異。根據(jù)標準曲線推導(dǎo)的方程，LOD估計為10?0.93 PFU。加入 103 個 PFU SARS-CoV-2 RNA 后，800 nm 發(fā)光壽命從 293 μs 猝滅到 265 μs，表明通過互補對之間的雜交，發(fā)生了從供體到受體的非輻射能量轉(zhuǎn)移56。最后，我們使用 30 個鼻咽 （NP） 拭子樣本測試了 LRET 測定與 BSNFs 芯片的臨床適用性。對于通過qRT-PCR確定為陽性的患者樣本，LRET檢測與BSNFs芯片相結(jié)合也產(chǎn)生了陽性結(jié)果，p值<0.0001。然而，LRET測定與常規(guī)提取方法相結(jié)合，產(chǎn)生了大量的假陰性結(jié)果（圖5d，e）。我們進行了受試者操作員特征 （ROC） 分析以檢查診斷準確性，其中使用 BSNFs-chip 的 LRET 測定成功區(qū)分了 SARS-CoV-2 陽性和陰性樣本，靈敏度為 100.0%，ROC 曲線下面積 （AUC） 值為 1（圖 5f，g）。相比之下，LRET測定與常規(guī)方法相結(jié)合的靈敏度較低，為30.0%，AUC值為0.597。這些結(jié)果表明，通過將快速診斷系統(tǒng)與基于BSNFs芯片的樣品制備相結(jié)合，用于病原體/NA富集，具有無PCR檢測傳染病的潛力。

我們開發(fā)了BSNFs芯片，這是一種具有雙孔納米結(jié)構(gòu)的樣品制備芯片，可協(xié)同增加表面積和表面滑移流的優(yōu)點。BSNFs芯片由成本低于1美元的PET薄膜制成，是一種具有成本效益的策略，封閉式系統(tǒng)降低了交叉污染的風(fēng)險。我們通過模擬和實驗對潛在機制進行了深入研究，證明了小孔隙和大孔隙在增加BSNFs表面積和滑移流方面的貢獻，甚至可以誘導(dǎo)納米渦旋，從而實現(xiàn)更好的NA隔離。基于通過模擬和實驗驗證的BSNFs芯片的高結(jié)合概率，我們評估了其使用基于PCR的方法富集病原體和NAs的有效性。與傳統(tǒng)提取方法相比，BSNFs芯片的LOD降低了100倍，這對于有效的傳染病檢測至關(guān)重要，尤其是在低病原體水平下。雖然單獨基于LRET的檢測的靈敏度低于基于PCR的方法，但一步法樣品富集系統(tǒng)和LRET檢測的集成可以成功區(qū)分SARS-CoV-2陽性和陰性樣本，靈敏度為100.0%。我們的無PCR傳感方法將精心設(shè)計的樣品制備系統(tǒng)與檢測系統(tǒng)相結(jié)合，為高效、靈敏地診斷傳染病鋪平了道路。未來的研究將側(cè)重于通過探索膠束聚集機制和精確的孔隙控制來擴展這些納米材料的適用性，包括設(shè)計定制的納米結(jié)構(gòu)，同時旨在加強 BSNFs 芯片與 LRET 檢測的集成，以將其綜合效用從 SARS-CoV-2 檢測擴展到更廣泛的病原體。我們預(yù)計，這種方法將在未來幾年內(nèi)在推進傳染病快速靈敏診斷方法領(lǐng)域發(fā)揮重要作用。

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