其次，未精確聚焦在液滴分選區(qū)域的高電場可能會導致不必要的雙重分選。基于DEP的液滴分選系統(tǒng)的電極通常是通過用鹽水或液態(tài)金屬填充微流體通道來制造的。不幸的是，這些類型的3D電極產生的電場沒有充分地定位在液滴分選區(qū)域內，并且可能無意中致動多個相鄰的液滴。這些電極的大覆蓋面積也導致通道中心的高電場強度，這增加了兩個相鄰液滴無意中合并的可能性。為了避免對靠近的多個液滴進行分選，通常會注入間隔油以進一步分離連續(xù)的液滴，這只允許單個液滴在任何給定時間點進入有效的液滴分選區(qū)域。然而，在長時間的運行中，穩(wěn)定地保持液滴之間的均勻間距可能很困難，特別是在進入的液滴尺寸不均勻的情況下，因為較小的液滴往往會因動量和阻力的差異而趕上較大的液滴。具有較大的液滴間距也會降低整體系統(tǒng)吞吐量。

圖2:NOVAsort的設計和概念驗證。

最后，需要更高的電壓來實現更高的吞吐量。由于分選效率由給定DEP力下可實現的最大液滴位移決定，該位移取決于DEP力作用于每個液滴的幅度和時間，因此需要更高的DEP力將液滴重定向到不同的出口。然而，在高電壓下（現有液滴分選機的典型工作電壓范圍為200至1000Vpp），與液滴的表面自由能相比，液滴的慣性增加，當向液滴施加位移力時，液滴保持其完整性，這可能會導致液滴撕裂。這種不必要的液滴分裂會嚴重混淆任何液滴分析的結果，也會限制分析吞吐量，特別是在相對較大的液滴（超過100?直徑為μm），其中這種較大的液滴通常更難操作，但在許多細胞分析應用中仍然是必需的。

我們在本文中描述了NOVAsort（下一代基于光電體積的精確液滴分選器）系統(tǒng)，該系統(tǒng)不僅可以根據液滴的熒光強度，還可以根據其大小對液滴進行分選。即使在高通量條件下，精確分選多分散液滴群體也可以顯著減少或消除由液滴分裂和/或液滴合并等無意影響引起的分選誤差。所提出的液滴分選器有效地解決了上述缺點和局限性，它利用了交叉電極（IDE），可以在微流體通道的底部產生高度局部化的電場，還利用載體油中水滴的自然浮力來選擇性地操縱特定尺寸范圍內的液滴。流通液滴熒光檢測裝置與反饋回路相結合，僅當檢測區(qū)域中的液滴強度超過設定的熒光閾值時，才激活IDE，因此僅收集正確尺寸的高熒光液滴，因為表面IDE產生的DEP力只能操縱特定尺寸范圍內的液滴。此外，平面IDE產生的高度局部化的電場僅移動位于IDE正上方的液滴，因此不會聚結相鄰的液滴或對非目標液滴進行分類。此外，激活的IDE充當“液滴導軌”，輕輕地將液滴引導到正確的出口，而不是傳統(tǒng)的液滴操縱器以銳角突然將液滴拉向不同的方向，這會導致液滴動量的突然變化，從而導致不必要的液滴剪切。最后，作為這種NOVAsort系統(tǒng)優(yōu)勢的概念驗證，進行了液滴體外轉錄/翻譯（IVTT）工作流程，并對由此產生的錯誤率和吞吐量進行了徹底的表征。

NOVAsort系統(tǒng)的工作原理

在多個步驟的液滴孵育和/或操縱操作后，液滴尺寸的均勻性可能會受到顯著影響。圖1A顯示了待分揀液滴庫的典型輸入液滴組成。在這里，液滴由小（破碎）、中（目標尺寸）和大（無意聚結）液滴組成，有或沒有熒光。然而，只有中等大小的熒光陽性液滴才是真正需要分類的。NOVAsort旨在處理這種高度多分散的輸入液滴庫。這是通過將基于尺寸的液滴分離與熒光激活的液滴分選相結合來實現的（圖1B）。NOVAsort的程序如圖1C所示。基于尺寸的液滴分離方法基于這樣一個事實，即水滴在其載體油中自然漂浮并漂浮到通道頂部，位于通道底部的IDE在通道底部產生非常局部的電場。填充通道高度的大液滴可以很容易地通過介電泳（DEP）力進行操縱，而浮起并因此遠離表面IDE的小液滴由于作用在這些小液滴上的DEP力不足而無法操縱（圖1D）。在這項工作中，通道高度被設計為比所需的液滴尺寸稍大（約10%），以便IDE產生的局部電場專門影響和引導具有正確尺寸的液滴。通過順序連接兩個這樣的基于尺寸的液滴操縱器（圖2A顯示了串聯連接的液滴高通和低通濾波器），可以僅分選出特定的液滴尺寸范圍。熒光檢測激光點放置在第二對IDE的開頭，IDE產生DEP力，以選擇性地僅對熒光陽性和正確尺寸的液滴進行分類。

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