腦膠質(zhì)瘤是最常見(jiàn)的原發(fā)性腦腫瘤類(lèi)型之一，占所有原發(fā)性腦腫瘤的近30%，所有惡性腦腫瘤的80%，中位生存時(shí)間約為12.5~15.0個(gè)月，手術(shù)切除、放療、烷化劑化療或靶向治療是腦膠質(zhì)瘤治療主要手段。盡管近年來(lái)腦膠質(zhì)瘤的生物學(xué)研究取得了很多進(jìn)展，但并沒(méi)有顯著改善患者的治療效果。目前，多數(shù)研究采用傳統(tǒng)的細(xì)胞模型、腫瘤球體模型、以嚙齒類(lèi)動(dòng)物為代表的體內(nèi)模型評(píng)估藥物的有效性，但這些模型不能真實(shí)預(yù)測(cè)藥物在臨床治療的療效，候選藥物在Ⅰ期臨床試驗(yàn)中的成功概率僅為3.4%，由于有效性不足和安全性差，最終階段的失敗率為54%。因此，迫切需要能夠真實(shí)反映人類(lèi)腦膠質(zhì)瘤疾病特征、微環(huán)境及其對(duì)治療藥物的反應(yīng)等特點(diǎn)的臨床前模型。

微流控芯片技術(shù)能實(shí)現(xiàn)在特定形狀的通道中精確操縱各種流體和化學(xué)參數(shù)，例如，營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)、流速、壓力、氧氣和pH值，提供可控的培養(yǎng)條件，從而仿真模擬人體組織和器官的微觀結(jié)構(gòu)和功能特征，在腦膠質(zhì)瘤相關(guān)研究如循環(huán)分離腫瘤細(xì)胞、藥物篩選、膠質(zhì)母細(xì)胞瘤進(jìn)展和細(xì)胞定位、模擬腫瘤與血流、缺氧和血管生成之間的相互作用等具有廣泛的應(yīng)用。筆者應(yīng)用腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞構(gòu)建了一種模擬腫瘤微環(huán)境的腦膠質(zhì)瘤微流控芯片模型，用兩種抗腫瘤藥物進(jìn)行藥效驗(yàn)證和模型評(píng)價(jià)，并進(jìn)一步探究中藥半枝蓮提取液抗腦膠質(zhì)瘤的療效，以期為尋找治療腦膠質(zhì)瘤中藥及其活性成分篩選提供技術(shù)支撐。

2.方法

2.1細(xì)胞培養(yǎng)

人神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞瘤細(xì)胞（U251）購(gòu)自于美國(guó)ATCC公司細(xì)胞庫(kù)，用含有10% FBS和1%青霉素-鏈霉素溶液的DMEM高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.2腦膠質(zhì)瘤芯片模型的構(gòu)建

使用Auto CAD軟件設(shè)計(jì)、標(biāo)準(zhǔn)光刻法制作了3個(gè)并列平行微流控通道結(jié)構(gòu)的U251微流控芯片模型，各通道間由微梯形柱結(jié)構(gòu)隔開(kāi)，中間通道為腦膠質(zhì)細(xì)胞瘤通道，兩側(cè)為培養(yǎng)基或含藥物培養(yǎng)基通道，如圖1A所示。將密度為2×107 cells/ml的U251細(xì)胞混懸液加入腦膠質(zhì)瘤通道中，兩側(cè)通道加入培養(yǎng)基或含藥培養(yǎng)基，構(gòu)成2D培養(yǎng)的腦膠質(zhì)瘤模型；3D培養(yǎng)的腦膠質(zhì)瘤模型則與等體積的基質(zhì)膠（4℃）進(jìn)行混合后，迅速將混合液加入腦膠質(zhì)瘤通道中，并將芯片置于培養(yǎng)箱中孵育30 min后，分別取20 μl預(yù)熱后的培養(yǎng)基加入兩側(cè)的微通道中。24 h后模型內(nèi)2D和3D培養(yǎng)的細(xì)胞狀態(tài)如圖1B所示，模型內(nèi)2D培養(yǎng)的細(xì)胞在芯片通道的底部貼壁生長(zhǎng)，而3D培養(yǎng)的細(xì)胞則嵌在3D基質(zhì)中不規(guī)則地生長(zhǎng)。

2.3芯片上細(xì)胞活力評(píng)價(jià)

采用Calcein AM/PI染色試劑盒評(píng)價(jià)芯片模型內(nèi)細(xì)胞的活力。首先，向介質(zhì)通道中加入PBS溶液，洗滌3次，每次持續(xù)5 min，以去除模型內(nèi)潛在的干擾物質(zhì)。在避光條件下，按照1 000∶2∶3（V/V/V）的比例將PBS、Calcein-AM和PI混合，制備成Calcein AM/PI染色工作液。取20 μl的染色工作液加入通道內(nèi)，將芯片放入溫度為37℃的恒溫箱中，孵育2 h。孵育結(jié)束后，使用PBS溶液輕柔沖洗通道，去除未與細(xì)胞結(jié)合的染色劑，重復(fù)3次，每次持續(xù)5 min。將處理好的芯片放置在熒光顯微鏡下進(jìn)行觀察并拍照記錄（在490 nm的激發(fā)波長(zhǎng)下觀察呈現(xiàn)綠色熒光的活細(xì)胞，545 nm的激發(fā)波長(zhǎng)下觀察呈現(xiàn)紅色熒光的死細(xì)胞）。

2.4腫瘤微環(huán)境表征

室溫下用PBS輕柔沖洗芯片模型內(nèi)的細(xì)胞5 min，重復(fù)3次；加入4%的多聚甲醛固定細(xì)胞，靜置10 min。用PBS輕柔沖洗通道內(nèi)的多聚甲醛5 min，重復(fù)3次；使用0.1% Triton X-100對(duì)細(xì)胞通透處理5 min，PBS洗滌細(xì)胞3次，每次5 min。室溫下用5%牛血清白蛋白（BSA）封閉細(xì)胞內(nèi)非特異性結(jié)構(gòu)1 h，使用重組HIF-1α抗體（1∶500）4℃孵育過(guò)夜，孵育完成后，使用PBS去除芯片模型內(nèi)殘留一抗。采用含Alexa Fluor 488熒光基團(tuán)的二抗（稀釋比1∶1 000）室溫避光孵育1 h，用PBS沖洗殘留的二抗后，加入DAPI避光孵育3 min，再用PBS沖洗通道3次，置于熒光顯微鏡觀察并拍照記錄。

2.5   U251芯片模型的活性評(píng)價(jià)

分別取適量陽(yáng)性藥儲(chǔ)備液，使用完全培養(yǎng)基分別稀釋成濃度為2.5、5、10、20 μmol/L的DOC工作液和100、200、300、400 μmol/L的TMZ工作液。在芯片兩側(cè)培養(yǎng)基通道中分別加入20 μl藥物工作液，24 h后采用Calcein AM/PI染色試劑盒評(píng)價(jià)陽(yáng)性藥在2D培養(yǎng)和3D培養(yǎng)條件下對(duì)芯片內(nèi)細(xì)胞活力的影響。

2.6芯片模型內(nèi)細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)

采用線(xiàn)粒體膜電位檢測(cè)試劑盒考察不同濃度的陽(yáng)性藥物對(duì)芯片模型內(nèi)細(xì)胞凋亡的影響。取20 μl的PBS加入培養(yǎng)基微通道，輕柔洗滌3次，每次間隔5 min。在避光條件下，將超純水、JC-1、JC-1染色液以160∶1∶40（V/V/V）的比例配制JC-1染色工作液。向介質(zhì)通道側(cè)加入20 μl染色工作液，將芯片放入細(xì)胞培養(yǎng)箱中，孵育2 h。孵育結(jié)束后，使用PBS溶液沖洗通道，去除未結(jié)合的JC-1染料，重復(fù)3次，每次間隔5 min。將芯片放置在熒光顯微鏡下進(jìn)行觀察并拍照記錄，在490 nm的激發(fā)波長(zhǎng)下，可以觀察到JC-1單體的熒光信號(hào)；525 nm的激發(fā)波長(zhǎng)下，可以觀察到JC-1聚合物的熒光信號(hào)。

2.7基于U251芯片模型的中藥半枝蓮藥效評(píng)價(jià)

2.7.1半枝蓮的提取

精密稱(chēng)取半枝蓮藥材細(xì)粉25 g（過(guò)5號(hào)篩），將其置于500 ml 75%乙醇中浸泡30 min，90℃加熱回流2次，分別提取2 h和1 h。合并2次的提取液，減壓濃縮，使用50%乙醇將濃縮液轉(zhuǎn)移至50 ml的容量瓶中，定容至刻度，即得濃度為500 mg/ml（藥材質(zhì)量/ml）的提取物濃縮液，備用。

2.7.2細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)

取200 μl過(guò)濾后的半枝蓮提取濃縮液（500 mg/ml），加入DMEM完全培養(yǎng)基，混勻得10 mg/ml含藥培養(yǎng)基溶液，依次稀釋得8、6、4、2、1、0.5、0.25 mg/ml含藥培養(yǎng)基溶液。

將細(xì)胞懸液按5 000個(gè)/孔接種到96孔板中，空白組不加細(xì)胞，置于培養(yǎng)箱孵育24 h，棄去各孔中的舊培養(yǎng)基，實(shí)驗(yàn)組各孔中分別加入含有不同濃度的半枝蓮溶液0.25、0.5、1、2、4、6、8 mg/ml，每孔100 μl；對(duì)照組各孔中均只加入細(xì)胞培養(yǎng)液，每孔100 μl，每個(gè)組5個(gè)平行。培養(yǎng)箱孵育24 h后，向各組每孔中加入10 μl的CCK-8試劑，于培養(yǎng)箱中避光孵育1 h，酶標(biāo)儀檢測(cè)450 nm波長(zhǎng)處各孔的A值。

2.7.3芯片模型內(nèi)半枝蓮的藥效評(píng)價(jià)

模型內(nèi)細(xì)胞活力評(píng)價(jià)：采用“2.7.2”項(xiàng)下毒性實(shí)驗(yàn)得到的濃度，模型內(nèi)加入2 mg/ml半枝蓮提取液培養(yǎng)24 h后，采用Calcein AM/PI染色試劑盒考察2D培養(yǎng)和3D培養(yǎng)條件下半枝蓮提取液對(duì)模型內(nèi)細(xì)胞活力的影響。

模型內(nèi)細(xì)胞凋亡評(píng)價(jià)：模型內(nèi)加入2 mg/ml半枝蓮提取液培養(yǎng)24 h后，采用線(xiàn)粒體膜電位檢測(cè)試劑盒考察2D培養(yǎng)和3D培養(yǎng)條件下半枝蓮提取液對(duì)模型內(nèi)細(xì)胞凋亡的影響。

2.8統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用Image J軟件計(jì)算熒光強(qiáng)度，GraphPad Prism 8軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，組間比較采用單因素方差分析，當(dāng)P<0.05時(shí)，表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

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